DNA螢光染色法
· 原理︰利用螢光染劑(bisbenzimide, Hoechst 33258)偵測(cè)支原體污染。此染劑會(huì)結(jié)合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich區(qū)域,因?yàn)橹гw之DNA中A-T含量占多數(shù)(55~80%),所以可將其染色而偵測(cè)。被支原體污染之細(xì)胞經(jīng)染色后,在細(xì)胞核外與細(xì)胞周圍可看到許多大小均一之螢光小點(diǎn),即為支原體之DNA,證明有支原體之污染。
· 特點(diǎn)︰簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)與靈敏,廣泛使用,可作為例行之偵測(cè)步驟??梢詡蓽y(cè)不易培養(yǎng)之支原體,例如M. hyorhinis,較直接培養(yǎng)法快,約一星期即可知道結(jié)果。
· 缺點(diǎn):有時(shí)仍會(huì)有螢光背景,影響判讀。
步驟:
· 取出培養(yǎng)之Vero細(xì)胞,吸除培養(yǎng)液。于每個(gè)well中加入2 ml 1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液,靜置10 min后,吸除固定液,用PBS洗滌三次。
· 于每個(gè)well中,加入1 ml Hoechst 33258 working solution,室溫下靜置5-10 min。
· 吸掉Hoechst 33258染液后,以無菌水洗滌3次,風(fēng)干后加入1滴的封片劑,并以蓋玻片覆蓋之。
· 以100x-400x螢光顯微鏡觀察。觀察細(xì)胞核外是否有藍(lán)色螢光小點(diǎn)或是絲狀點(diǎn)之螢光物產(chǎn)生。
結(jié)果判讀︰
若有支原體污染,在Vero細(xì)胞核外與細(xì)胞表面會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色螢光小點(diǎn)或是絲狀點(diǎn)。其形狀一致,與細(xì)胞殘片染成之不規(guī)則點(diǎn)狀物不同。其螢光可維持?jǐn)?shù)星期。
圖例 (A)為negative result : 螢光顯微鏡下,只觀察到Vero細(xì)胞的細(xì)胞核,測(cè)試樣品沒有支原體的污染。(為positive result : 在Vero細(xì)胞核外與細(xì)胞表面會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色螢光小點(diǎn)和絲狀點(diǎn),表示測(cè)試樣品有支原體的污染。
(A)Negative result
螢光顯微鏡下,只觀察到Vero細(xì)胞的細(xì)胞核,測(cè)試樣品沒有支原體的污染。
(Positive Result 在Vero細(xì)胞核外與細(xì)胞表面會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色螢光小點(diǎn)和絲狀點(diǎn),表示測(cè)試樣品有支原體的污染。
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